s1

Zásady mikroskopování mikroskopických preparátů

Od mikroskopu očekáváme kvalitní zobrazení mikroskopických objektů a na druhé straně mikroskop „očekává“ recipročně od nás, že s ním budeme správně zacházet. Na chybné zacházení mikroskop „odpoví“ obrazovými vadami. Proto je nejen užitečné, ale rovněž nezbytné se teoreticky a posléze prakticky seznámit s nejdůležitějšími zásadami správného mikroskopování. S hlavními zásadami se student seznámí již na prvním praktickém cvičení a v průběhu celého semestru se naučí správně pracovat s mikroskopem. To znamená naučí se najít rychle obraz objektu, mít v mikroskopu správné osvětlení, pohotově měnit zvětšení a pozorovat a studovat kvalitní obraz. Jenom takto může prostudovat větší počet preparátů v relativně krátké době.

Z výše uvedených důvodů je užitečné si osvojit ihned od začátku správné postupy mikroskopování a zbavit se těch potenciálně nesprávných. Po určité době bychom při mikroskopování již neměli přemýšlet o tom, čím a jak pohnout v mikroskopu, abychom získali kvalitní obraz objektu. K těmto zásadám patří rovněž obecné zásady dodržování čistoty a hygieny při práci s mikroskopem a zvláště s jeho jemnou optikou. Neboť velmi často se prach a nečistoty na čočkách okuláru a objektivu a na filtru stávají zdrojem nekvalitního obrazu.

1. Pracovní umístění mikroskopu

Před vlastním mikroskopováním sundáme z mikroskopu obal z PVC a mikroskop umístíme nosičem tubusu k sobě až k okraji stolu. Před něj umístíme lampu a napravo sešit či papír určený pro nákres preparátu a poznámky. Otáčecí židli vytočíme do takové výše, abychom mohli pohodlně sedět, pozorovat, kreslit a psát poznámky. Mikroskop je nutné zachovat při mikroskopování ve svislé poloze, kdy není nosič tubusu nakloněn. Odpadá tak velké nebezpečí sklouznutí preparátu ze stolku mikroskopu a jeho rozbití. Navíc, není třeba vždy upevňovat preparát příchytkami na stolku, což umožňuje při menších zvětšeních pohybovat preparátem prsty obou rukou.

2. Seřízení osvětlení

Máme-li mikroskop správně umístěn na pracovním stole, můžeme seřídit osvětlení, které je nezbytné pro pozorování preparátů. Osvětlovací lampu rožneme a postavíme ve vzdálenosti 15-20 cm od mikroskopu tak, aby světelný kužel směřoval proti zrcátku umístěném pod stolkem mikroskopu. Světlo zachytíme dutou (konkávní) plochou zrcátka přibližně do optické osy mikroskopu. Dbáme na to, aby byla clona otevřená a kondenzor se nacházel v dolní poloze. Na revolverovém zařízení pro výměnu objektivů nastavíme nejméně zvětšující objektiv, který otáčením makrometrického šroubu opatrně spustíme na doraz dolů směrem k pracovnímu stolku. K dalšímu seřízení světla je nutno pohlédnout do okuláru a pohybem zrcátka nastavit takový odraz světla do kondenzoru a objektivu, aby bylo celé zorné pole rovnoměrně a intenzívně osvětleno. Pozitivní kontrolu správnosti tohoto nastavení si můžeme velmi jednoduše provést pomocí tužky. Dáme-li před čočku lampy hrot tužky, musí být ostře promítnut v zorném poli. Není-li, pohybujeme kondenzorem nahoru, popřípadě dolů do polohy, než se hrot zaostří.
Častou chybou je částečně osvětlené zorné pole. V takovém případě je nutno se přesvědčit, jestli je objektiv umístěn v optické ose mikroskopu a zajištěn západkou. Není-li tento problém způsoben nesprávným umístěním objektivu, je třeba hledat závadu v nesprávném nastavení zrcátka nebo lampy.

3. Umístění preparátu

Po seřízení osvětlení máme mikroskop připraven k prohlížení preparátů. Preparát opatrně vyjmeme z krabice a položíme jej na stolek mikroskopu. Je nutno mít na paměti, že preparát musí být vždy umístěn krycím sklíčkem nahoru ! Dále je nutno mít na paměti, že preparát musí být umístěn tak, aby řez tkání (který je zpravidla uprostřed preparátu) byl situován uprostřed otvoru stolku mikroskopu !

4. Zaostření preparátu

Máme-li preparát umístěn na stolku mikroskopu, je nutné mít nastaven tubus na nižší, než pracovní vzdálenost, do tzv. „startovní pozice“, což jsme již provedli při seřízení osvětlení (viz.1.2.2.). Pohlédneme do okuláru, jedno oko přivřeme a současně pomocí makroškoubu velmi jemně a pomalu zvedáme tubus do té polohy, až se nám promítne v okuláru pozorovaný objekt. Tímto způsobem získáme většinou hrubě zaostřený obraz, který je nutno korigovat doostřením pomocí mikrošroubu. Při zaostřování preparátu se může student velmi často dopustit „začátečnické“ chyby, kdy zvláště při rychlém zvedání tubusu přehlédne rovinu zaostření preparátu, která se zobrazí na velmi krátkou dobu (pro lidské oko mnohdy nezachytitelnou). V takovém případě je nutné začít znovu, tzv. snížit tubus do startovní pozice a celý proces opakovat.

5. Prohlížení preparátu

Máme-li obraz preparátu zaostřen, prohlédneme si jej nejprve celý, abychom získali základní informaci o jeho charakteristice. Pohybem preparátu se přesvědčíme, zda vůbec pozorujeme zvolený objekt. Často se totiž stává, že při nedokonalé čistotě skel dojde k zaostření na nečistotu a ne na hledaný objekt. V takovém případě se pozorovaná nečistota jeví jako nezbarvený, zrnitý, silně světlolomný a nestrukturální objekt. Oproti tomu, preparát se vyznačuje většinou barevnými strukturami s převahou červené, fialové a modré barvy (viz níže). Máme-li preparát prohlédnut při malém zvětšení, je nutné změnit objektiv pro možnost většího zvětšení k prostudování detailů pozorovaného objektu. Změnu objektivu provedeme tak, že otočíme revolverovým zařízením mikroskopu a nastavíme objektiv, zvětšující 20x do optické osy mikroskopu. Při této proceduře není nutno měnit pracovní vzdálenost (zvedat tubus), neboť mikroskopy jsou seřízeny tak, aby po změně objektivu bylo možno zachytit pozorovaný objekt v hrubém zaostření. Tedy, po změně objektivu pouze doostříme obraz mikrošroubem. Jak již bylo uvedeno, každý preparát začínáme mikroskopovat vždy od nejmenšího zvětšení, neboť při něm vidíme větší plochu zkoumaného preparátu, která obsahuje více rozmanitých struktur. A dále, malé zvětšení umožňuje vidět ve vzájemných prostorových souvislostech všechny částí (vrstvy) pozorované tkáně či orgánu. Na této ploše také lépe nalezneme zkoumaný objekt, který si orientačně prohlédneme. Poté objekt umístíme do středu zorného pole a vyměníme objektiv s větším zvětšením, který umožní podrobnější studium objektu. Při mikroskopování si zvykneme mít obě oči otevřené, čímž můžeme střídavě pozorovat preparát (zpravidla levým okem) a kreslení preparátu do protokolu (zpravidla pravým okem).

6. Kresba preparátu – zhotovení protokolu

Každý mikroskopický preparát, který pozorujeme na praktických cvičeních, je nutno zakreslit do protokolu! K tomu je nutné, aby si student obstaral nelinkované, volné listy papíru formátu A4, obyčejnou měkkou černou tužku a modrou a červenou pastelku. Tyto uvedené pomůcky jsou nutné k vyhotovení protokolu mikroskopických preparátů. Na str. 11 je uveden vzor protokolu, který je nutno dodržet! Při kresbě preparátu kreslíme jeho zvětšený obraz, aby bylo možno zaznamenat a správně popsat detaily. Nejprve kreslíme hrubé obrysy a poté detaily zvětšeného objektu. Kresbu preparátu pojímáme nikoliv umělecky, ale spíše poloschematicky. Ke kresbě si při nejmenším zvětšení vybereme na preparátu nejvhodnější místo, které vyjadřuje specifitu stavby dané tkáně či orgánu. K dosažení detailů jej poté zvětšíme podle potřeby a zakreslíme včetně popisu. Popis jednotlivých komponent preparátu je nutno uvádět věcně správně, neboť protokoly slouží studentu především jako pomůcka při přípravě ke zkoušce. Proto je nutné se na praktická cvičení předem teoreticky připravovat, aby student praktickou látku zvládl. Rovněž je důležité, aby student po absolvování cvičení byl schopen poznat a popsat preparát, který studoval.

7. Ukončení práce s mikroskopem

Pokud student skončí s mikroskopováním, je nutné uvést mikroskop, příslušenství a preparáty do původního stavu jako před mikroskopováním. Nejprve sklidit preparát, který je nutné vrátit na původní místo do krabice, které odpovídá jeho číslu a označení na seznamu. Poté otočit revolverovým zařízení a nastavit objektiv s nejmenším zvětšením (6x) do optické osy mikroskopu. Vypnout lampu a na mikroskop nasadit obal z PVC. Teprve poté může student opustit cvičebnu.