SVĚTELNÝ MIKROSKOP

     V úvodu této kapitoly je třeba připomenout, že světelná mikroskopie je základní metodou pozorování ve všech biologických disciplínách, jejichž předmětem studia je buňka (tkáň, pletivo, orgán). Pro studium mikroskopické stavby jednotlivých tkání a orgánů hospodářských zvířat slouží na praktických cvičeních studentům dva základní prostředky. Na jedné straně to jsou trvalé, histologické preparáty jednotlivých tkání a orgánů a na druhé straně světelný mikroskop. Histologické preparáty představují zdroj potřebných informací detailní stavby tkání a orgánů hospodářských zvířat. K samotnému studiu těchto preparátů je nezbytný světelný mikroskop, který umožňuje zvětšení obrazu ve více úrovních a tím snadnější poznání a pochopení mikroskopické stavby jednotlivých objektů. Vzhledem k tomu, je nutné a především praktické znát stavbu světelného mikroskopu a umět s ním správně pracovat. Proto budou níže následovat hlavní a nejdůležitější údaje o složení a o technických parametrech světelného mikroskopu a rovněž zásady mikroskopování.

Složení světelného mikroskopu

     Na praktických cvičeních se používají mikroskopy světelné, které zvětšují obraz objektu usměrněním světelných paprsků skleněnými čočkami. Ve spojitosti s principem zvětšení objektů ve světelném mikroskopu je nutno mít na paměti, že faktorem technického použití  tohoto mikroskopu je vlnová délka spektra světla. Na ní přímo závisí rozlišovací schopnost mikroskopu, kterou považujeme za kritický faktor získání kvalitního mikroskopického obrazu. Rozlišovací schopnost definujeme jako nejmenší vzdálenost mezi dvěma částicemi, při které je dokážeme rozlišit jako dva samostatné objekty. Například, rozeznáme-li dvě částice od sebe vzdálené 0,2 µm je rozlišovací schopnost použitého mikroskopu 0,2 µm. Avšak v mikroskopu s rozlišovací schopností 0,5 µm se nám budou jevit jako jediný bod. Rozlišovací schopnost nejlepších světelných mikroskopů se pohybuje právě okolo 0,2 µm, což poskytuje dobrý obraz při zvětšení 1000 až 1500 krát. Kvalita obrazu – jeho jasnost a bohatství detailů – je tedy dána rozlišovací schopností mikroskopu. Zvětšení mikroskopu je na rozlišovací schopnosti sice nezávislé, avšak samo o sobě bezcenné, není-li doprovázeno dostatečným rozlišením. Neboť rozlišovací schopnost mikroskopu závisí především na čočce objektivu, protože okulár pouze zvětší obraz objektivem získaný, tzn. že se tím rozlišení nezlepší. Z toho je zřejmé, že má světelný mikroskop relativně omezené užití. Sestrojením a využitím jiných typů mikroskopů (zvláště transmisního elektronového mikroskopu) a zavedením různých moderních zobrazovacích metod byl světelný mikroskop technicky a prakticky překonán.
     I přes tento fakt představuje v současné době světelný mikroskop nejfrekventovanější prostředek k poznání a studiu na poli jak vědeckovýzkumné práce, tak rovněž při výuce na biologicky zaměřených univerzitách. Světelné mikroskopy prodělaly od svého vzniku relativně velký technický pokrok, který spočívá zvláště ve zlepšování komfortu práce se samotným mikroskopem. Světelné mikroskopy proto existují v mnoha typech a modifikacích, podle jejich specifického využití v různých biologických oborech. V současné době se často používá světelný mikroskop jako zdroj analogového obrazu objektu, který je "digitalizován" a analyzován pomocí speciálního software s využitím výpočetní techniky. Tato tzv. počítačová analýza obrazu umožňuje relativně rychlejší a přesnější kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení pozorovaných objektů s možností statistického zpracování sledovaných hodnot a s vysoce kvalitními grafickými výstupy. Na praktických cvičeních pro potřeby studia mikroskopické stavby tkání a orgánů hospodářských zvířat studentům plně dostačuje "obyčejný" světelný mikroskop. Proto používáme k mikroskopování dvou typů mikroskopů: monokulárního a binokulárního mikroskopu. Schematizovaná stavba světelného mikroskopu je uvedena na obr. 1. Jak je z obrázku patrné, skládá se světelný mikroskop ze dvou základních částí: ze statické části (stativ) a optické části. Nezbytným doplňkem pro mikroskopování je osvětlovací zařízení světelného mikroskopu.

1. Statická část mikroskopu

Statická část mikroskopu představuje konstrukčně pevnou "kostru" mikroskopu, která zajišťuje jeho stabilitu a rovněž nese optickou část mikroskopu. Ke statickým částem mikroskopu patří stativ, nosič tubusu, stolek mikroskopu, tubus,  revolverový měnič objektivů a osvětlovací zařízení. Stativ mikroskopu má většinou tvar podkovy a je masivní, aby měl mikroskop dostatečnou stabilitu. Stativ je spojen sloupkem s nosičem tubusu a se stolkem. Nosič tubusu nese tubus s optickou částí mikroskopu, stolek a osvětlovací zařízení. V horní části tubusu je zasunut různě zvětšující okulár (většinou 10 krát). Jak již bylo uvedeno, na našich praktických cvičeních se k mikroskopování používají dva typy mikroskopů, a to starší monokulární a novější binokulární mikroskopy. Základním rozdílem, který je zřejmý z použitého označení, je fakt, že tubus monokulárního mikroskopu obsahuje pouze jeden okulár a u binokulárního dva. Další rozdíly jsou mezi oběma typy mikroskopů uvedeny níže při popisu jejich některých stavebních komponent. V dolní části tubusu nad stolkem se nachází revolverové zařízení, ve kterém jsou upevněny tři objektivy. Otáčením revolverového zařízení lze libovolný objektiv nastavit do optické osy mikroskopu. Tubus je posunován vůči nosiči tubusu u monokulárního mikroskopu dvěma šrouby, makrometrickým a mikrometrickým. Makrometrický šroub slouží k hrubému posunu a k hrubému zaostření preparátu. Mikrometrický šroub slouží k posuvu jemnému a tím k přesnému zaostření pozorovaného preparátu. Otáčením makro- i mikrošroubu směrem od sebe dochází k posuvu tubusu dolů, otáčením k sobě pak k posuvu nahoru. Toto pravidlo je nutno si zapamatovat, aby nedošlo při mikroskopování k poškození preparátu, objektivu nebo jemného mechanismu posuvu. U binokulárního mikroskopu je mikro a makrošroub umístěn v jedné ose na nosiči tubusu pod úrovní stolku. Stolek mikroskopu slouží k umístění a upevnění preparátu. Je nejčastěji kruhového nebo čtvercového tvaru, uprostřed je vybaven otvorem a na okrajích uchycovacím zařízením pro pozorovaný preparát. U monokuláru jsou stolky většinou pevné a nebo se dají posouvat pomocí dvou šroubů směřujících od obvodu stolku do jeho středu ve dvou na sebe kolmých směrech. U binokuláru se nachází tzv. křížový stolek, jehož horní deska je pohyblivá ve dvou na sebe kolmých směrech pomocí šroubu vpravo na okraji stolku.

2. Optická část mikroskopu

Optická část mikroskopu je tvořena dvěma systémy čoček (objektivy a okuláry) jejichž funkcí je zvětšit pozorovaný objekt. Objektiv představuje systém čoček upevněných v objímce, zašroubované v revolverovém zařízení světelného mikroskopu, a je tedy umístěn blíže objektu. Objektiv vytváří přímé skutečné primární zvětšení pozorovaného objektu. Objektivy dělíme mimo jiné na suché a imerzní. U suchých objektivů (zpravidla objektivy zvětšující 45 až 60 násobně) je mezi pozorovaným preparátem a objektivem vzduch. Při použití imerzních objektivů (silně zvětšujících až 100 násobně) je prostor mezi čelní čočkou objektivu a preparátem vyplněn imerzním olejem, popřípadě vodou. Na praktických cvičeních mají studenti k dispozici mikroskopy, které v revolverovém zařízení mikroskopu obsahují tři různě zvětšující objektivy (se zvětšením 6 krát, 20 krát a 45 krát).  Všechny tři objektivy jsou suché a dovolují prostudovat pozorovaný preparát celkem třemi rovinami zvětšení (60 krát, 200 krát a 450 krát za použití desetinásobně zvětšujícího okuláru). Imerzní objektivy nepoužíváme, neboť k plnohodnotnému prostudování preparátu plně dostačují instalované suché objektivy a navíc zde odpadá relativně časově náročná manipulace s imerzním olejem a čištěním imerzních objektivů a preparátů. Objímka objektivů obsahuje důležitá data, jako je: zvětšení objektivu, typ objektivu a numerická apertura. Z uvedených údajů lze pak vyčíst charakteristiku daného objektivu.
     Jak již bylo uvedeno, číslo zvětšení objektivu udává násobek přímého zvětšení pozorovaného objektu objektivem. Přičemž platí, že celkové zvětšení mikroskopu je dáno součinem vlastních zvětšení použitého objektivu a okuláru. Pro určitý objektiv existuje horní hranice celkového zvětšení mikroskopu, tzv. užitečné zvětšení. Užitečné zvětšení mikroskopu představuje přibližně 500 – 1000 násobek numerické apertury. Je-li tato hodnota překročena, nevydá již objektiv více podrobností ve zvětšeném obraze, takže další zvětšení je již „prázdné“. Numerická apertura určuje rozlišovací schopnost objektivu, užitné zvětšení a světelnost objektivu a také hloubku obrazu nebo-li penetrační schopnost objektivu. Vysoká numerická apertura a tím i vysoká rozlišovací schopnost objektivu je důležitá u silně zvětšujících objektivů, zvláště u objektivů imerzních. Imerzní objektivy mají však na druhé straně menší světelnost a penetrační schopnost. Ohnisková vzdálenost objektivu vyjadřuje ohniskovou vzdálenost celé soustavy čoček objektivu a kolísá podle zvětšení objektivu od 30 mm do 1,5 mm. Z této hodnoty vyplývá tzv. pracovní vzdálenost nebo-li vzdálenost čelní čočky objektivu od preparátu. Přičemž platí, že volná pracovní vzdálenost je tím menší, čím je větší zvětšení objektivu. Například u objektivů zvětšujících 45 x je volná vzdálenost asi 0,4 mm a u imerzního objektivu dokonce 0,17 mm. Okuláry představují, stejně jako objektivy, systém čoček, který se nasazuje do horní části tubusu a je tedy umístěn blíže oku pozorovatele. Okulár vytváří sekundární zvětšení pozorovaného obrazu objektu (zvětšení již jednou objektivem zvětšeného objektu). Okuláry se používají většinou se zvětšením 10 krát, popřípadě 20 až 25 krát.

3. Osvětlovací zařízení světelného mikroskopu

Osvětlovací zařízení světelného mikroskopu tvoří kondenzor, irisová clona, filtry, zrcátko a světelný zdroj. Kondenzor je uložen pod stolkem mikroskopu a skládá se z několika čoček. Dá se posunovat kolmo nahoru a dolů pomocí ovládacího šroubu umístěného nalevo pod stolkem. Kondenzor je složen ze systému čoček koncentrujících světlo, procházející pozorovaným preparátem a optickou částí mikroskopu. Pohybem nahoru se kužel procházejícího světla zmenšuje a zintenzivňuje, což je důležité zvláště při velkých zvětšeních. Irisová clona se nachází těsně pod kondenzorem, je odklopná do strany a ovládaná zahnutou černou páčkou v obvodu objímky. Její funkcí je ovlivňování kontrastu, tj. zmenšováním otvoru clony dochází ke zvyšování kontrastu obrazu pozorovaného objektu. Filtr je uložen pod irisovou clonou ve výsuvné objímce, je vyroben z modrého skla a používá se hlavně při umělém světle. Jeho funkcí je eliminovat pro lidské oko dráždivou červenou složku světla žárovky. Ze světelného zdroje usměrňuje paprsky světla do optické osy monokulárního mikroskopu pohyblivé zrcátko umístěné pod filtrem. Jedna plocha zrcátka je rovná a je určena pro denní světlo. Druhá plocha je konkávní a je určena pro světlo umělé, které se z lampy odráží směrem do optické osy mikroskopu. Samotným zdrojem umělého osvětlení světelného mikroskopu je tzv. Šiklova lampa. Umělé světlo žárovky prochází sběrnou čočkou lampy a mléčným filtrem směrem k zrcátku mikroskopu. U binokulárního mikroskopu existuje vestavěné osvětlovací zařízení přímo ve stativu a představuje objímku, žárovku a hranol. U těchto typů mikroskopů pochopitelně chybí zrcátko a osvětlovací lampa.